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Nov 12, 2023

Nature Chemical Biology volume 18, pages 385–393 (2022)Citer cet article

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Les biocapteurs acellulaires sont de puissantes plateformes de surveillance de la santé humaine et environnementale. Ici, nous étendons leurs capacités en les interfaçant avec des circuits de déplacement de brin médiés par les orteils, une nanotechnologie dynamique de l'ADN qui permet le calcul moléculaire grâce à des interactions programmables entre les brins d'acide nucléique. Nous développons des règles de conception pour interfacer une plate-forme de détection de petites molécules appelée ROSALIND avec un déplacement de brin médié par les orteils pour construire des circuits hybrides ARN-ADN qui permettent un réglage fin de la cinétique de réaction. Nous utilisons ces règles de conception pour construire 12 circuits différents qui implémentent une gamme de fonctions logiques (NOT, OR, AND, IMPLY, NOR, NIMPLY, NAND). Enfin, nous démontrons un circuit qui agit comme un convertisseur analogique-numérique pour créer une série de sorties binaires qui codent la plage de concentration de la molécule détectée. Nous pensons que ce travail ouvre la voie à la création de diagnostics "intelligents" qui utilisent des calculs moléculaires pour améliorer la vitesse et l'utilité des biocapteurs.

La biodétection sans cellules est en train de devenir une plate-forme technologique de diagnostic peu coûteuse, facile à utiliser et déployable sur le terrain, capable de détecter une gamme de composés chimiques liés à la santé humaine et environnementale1,2. À la base, ces systèmes se composent de deux couches : une couche de biodétection à base d'ARN ou de protéines et une couche de sortie de construction de rapporteur. En câblant génétiquement ces couches, un signal est généré lorsque le composé cible se lie au biocapteur et active l'expression du rapporteur (Fig. 1). Les réactions sont assemblées en incorporant ces couches dans des systèmes sans cellule et en les lyophilisant pour faciliter le stockage, le transport et la réhydratation avec un échantillon d'intérêt au point de besoin1,3. En utilisant cette approche, les biocapteurs acellulaires ont détecté avec succès des composés liés à la santé humaine tels que le zinc4 et les molécules de détection de quorum provenant de bactéries pathogènes5, des médicaments tels que le gamma-hydroxybutyrate6 et des contaminants de l'eau tels que le fluorure1, l'atrazine2, les antibiotiques et les métaux lourds7.

(En haut) Un biocapteur acellulaire s'active généralement lorsqu'un composé cible (entrée) se lie à un facteur de transcription protéique (couche de capteur) qui est configuré pour activer l'expression d'une construction rapporteur (couche de sortie). Il en résulte la production d'un signal détectable tel que la fluorescence. (Bas) L'ajout d'une couche de traitement de l'information en aval avant la génération du signal peut améliorer les performances et étendre la fonction des biocapteurs sans cellule en ajoutant des fonctionnalités de calcul telles que le traitement logique et la comparaison des signaux. Ici, ceci est mis en œuvre en câblant la couche de sortie de biodétection pour produire un ARN simple brin capable d'activer des circuits de déplacement de brin médiés par les orteils qui génèrent un signal.

Cependant, les biocapteurs acellulaires existants manquent souvent d'une couche de traitement de l'information qui peut manipuler les réponses de la couche de détection avant la génération du signal (Fig. 1). Ces couches de traitement de l'information sont une caractéristique naturelle des organismes et permettent aux cellules d'activer les réponses au stress, de guider le développement et de prendre des décisions comportementales sur la base de signaux intracellulaires et extracellulaires8. Pour cette raison, les couches de traitement de l'information génétique qui implémentent la logique et la rétroaction ont été largement exploitées et conçues dans des systèmes cellulaires synthétiques9,10. De même, nous avons précédemment montré que des circuits à base d'ARN peuvent être ajoutés à une plate-forme de biocapteurs sans cellule appelée RNA Output Sensors Activated by Ligand INDuction (ROSALIND) pour améliorer leur spécificité et leur sensibilité sans ingénierie des biocapteurs protéiques7. Cependant, ces circuits agissent toujours directement sur la couche de détection ou de sortie, limitant notre capacité à améliorer et à étendre leur fonction.

Ici, nous développons une couche de traitement de l'information généralisable pour améliorer et étendre la fonction de ROSALIND en tirant parti du déplacement de brin d'ADN médié par les orteils (TMSD) - une nanotechnologie d'ADN puissante en termes de calcul qui peut traiter les informations moléculaires in vitro11. Dans TMSD, les entrées d'ADN simple brin (ssDNA) échangent des brins avec des «portes» d'ADN double brin via des interactions d'appariement de bases complémentaires pour produire des brins de sortie d'ADNss. En configurant les portes ADN dans différentes architectures de réseau, une gamme d'opérations peut être effectuée, telle que la restauration du signal12, l'amplification du signal13 et le calcul logique14,15, un peu comme une architecture informatique chimique générale16. La thermodynamique bien caractérisée de l'appariement de bases d'ADN permet de construire de grands réseaux à partir de simples blocs de construction. De plus, la cinétique de la réaction peut être ajustée avec précision en modifiant la force des « points d'appui », des régions à un seul brin au sein des portes de l'ADN qui initient le processus de déplacement du brin17. Le TMSD a conduit au développement de dispositifs puissants, notamment des oscillateurs in vitro18, des amplificateurs catalytiques19, des moteurs moléculaires autonomes20,21 et des nanostructures d'ADN reprogrammables22,23. Ainsi, il existe un grand potentiel pour le traitement de l'information basé sur TMSD pour améliorer les biocapteurs sans cellule.

Bien que les circuits TMSD aient été utilisés pour détecter des cibles d'acide nucléique telles que les microARN24,25 et les agents pathogènes humains26, il n'existe actuellement aucune règle de conception générale pour déclencher les circuits TMSD avec de petites molécules afin de permettre leur utilisation dans des biocapteurs acellulaires. Nous avons donc cherché à créer une interface capable de convertir l'événement de liaison d'une cible chimique en modifications des brins d'acide nucléique pouvant déclencher des cascades TMSD. Les facteurs de transcription allostériques (aTF) créent naturellement cette interface en activant la transcription d'une séquence d'ARN programmable lors de la détection d'une cible chimique. Cependant, il existe des défis importants dans la combinaison des circuits aTF et TMSD pour fonctionner ensemble in situ, tels que l'interférence entre l'ARN polymérase (RNAP) et les portes d'acide nucléique27, le manque de caractérisation expérimentale des circuits TMSD médiés par l'ARN28 et les complexités du repliement de l'ARN entravant la fonction du circuit TMSD.

Ici, nous relevons ces défis en développant des règles de conception pour interfacer les couches de détection de ROSALIND7 avec les circuits TMSD. Nous montrons d'abord que la conception d'une nouvelle porte de signal d'ADN peut être optimisée pour permettre la transcription in vitro (IVT) et la TMSD pilotées par T7 RNAP dans la même réaction. Ensuite, nous développons les règles de conception de la structure secondaire de l'ARN pour ajuster la cinétique de réaction du TMSD, améliorant notamment la vitesse de réponse. Nous appliquons également ce principe pour interfacer TMSD avec plusieurs aTF différents afin de créer des biocapteurs pour leurs ligands apparentés. Nous présentons ensuite la programmabilité de la plate-forme en construisant 12 circuits différents qui implémentent sept fonctions logiques différentes (NOT, OR, AND, NOR, IMPLY, NIMPLY, NAND). Enfin, en utilisant une approche basée sur un modèle, nous construisons un circuit TMSD multicouche qui agit comme un convertisseur analogique-numérique (ADC) pour créer une série de sorties binaires qui codent la plage de concentration de la molécule cible. Pris ensemble, ces travaux démontrent que TMSD peut être utilisé pour mettre en œuvre des calculs moléculaires afin d'étendre les capacités des biocapteurs sans cellules.

Pour interfacer ROSALIND avec TMSD, nous avons d'abord cherché à valider qu'un ARN simple brin peut déplacer un brin d'une porte de signal d'ADN. Nous avons modifié une porte de signal d'ADN d'un travail précédent pour créer une porte avec une pointe de huit nucléotides sur son extrémité 3', avec un brin marqué avec un fluorophore et l'autre brin avec un extincteur (Données supplémentaires 1)29. Nous avons ensuite conçu un brin d'ARN envahissant (InvadeR) pour qu'il soit entièrement complémentaire du brin de fluorophore afin qu'il déplace le brin d'extincteur pour générer une sortie fluorescente. Lorsque nous avons combiné InvadeR purifié avec la porte de signal d'ADN, nous avons observé une activation de la fluorescence par rapport à un contrôle sans InvadeR (Figs. 1 et 2a supplémentaires). De cette manière, InvadeR s'est comporté de la même manière qu'un brin d'ADNsb envahissant (InvadeD), bien que le titrage d'InvadeR ait entraîné un plateau de fluorescence à des concentrations inférieures à InvadeD (Fig. 2a, b supplémentaires). Notamment, NUPACK30 prédit qu'InvadeD a une structure moins stable qu'InvadeR et qu'InvadeR peut se lier à lui-même pour former un duplex, ce qui pourrait inhiber la fonction d'InvadeR (Fig. 2c – e supplémentaire, données supplémentaires 2 et 3).

Nous avons ensuite déterminé si InvadeR peut être transcrit in situ en présence de la porte du signal d'ADN pour générer un signal. Suite à la conception de la plate-forme ROSALIND, nous avons choisi une polymérase de phage processive rapide, T7 RNAP, et configuré la matrice d'ADN pour qu'elle se compose de la séquence minimale du promoteur T7 de 17 paires de bases (pb) suivie de deux guanines d'initiation et de la séquence InvadeR (Données supplémentaires 1). Nous avons initialement observé que l'ARNP T7 pouvait générer un signal fluorescent à partir de la seule porte du signal d'ADN (Extended Data Fig. 1b). Sur la base de rapports précédents27, 31, 32, 33, nous avons émis l'hypothèse que l'ARNP T7 initiait la transcription à partir de la région 3 'de la porte du signal de l'ADN, provoquant le déplacement du brin et la génération du signal (Extended Data Fig. 1a). Pour tester cette hypothèse, nous avons inversé la polarité de la porte du signal d'ADN pour inclure une extrémité 5 'toehold et n'avons observé aucun signal de fluorescence provenant de la porte du signal ADN 5' toehold (Extended Data Fig. 1b). L'analyse par électrophorèse sur gel d'urée-polyacrylamide (urée-PAGE) des espèces d'ARN de chaque réaction IVT a également montré des produits secondaires d'ARN uniquement de la réaction avec la porte de signal d'ADN 3 'toehold (Extended Data Fig. 1c). Nous avons confirmé que la 2′-O-méthylation de la porte du signal d'ADN33 élimine de la même manière la fausse transcription (Extended Data Fig. 1d – f).

Avec la conception optimisée de la porte du signal d'ADN, nous avons ensuite utilisé TMSD pour suivre les sorties d'ARN générées par l'IVT pilotée par T7 RNAP in situ. Nous nous sommes concentrés sur l'optimisation de la conception d'InvadeR pour une génération rapide de signaux. Sur la base des résultats de la Fig. 2 supplémentaire, nous avons émis l'hypothèse que la structure secondaire d'InvadeR jouerait un rôle critique dans l'efficacité du TMSD, par exemple en interférant avec la liaison des orteils et l'invasion des brins34,35. Pour tester cette hypothèse, nous avons conçu cinq variantes différentes d'InvadeR, chacune avec des stabilités prédites et des structures secondaires variables à l'extrémité 3' (Fig. 2a). Lorsqu'une quantité équimolaire de chaque variant InvadeR purifié sur gel a été ajoutée à la porte du signal d'ADN, nous avons observé que les amplitudes des signaux de fluorescence étaient ordonnées en fonction des énergies libres minimales prédites de chaque variant (Fig. 2b). En outre, chaque version renforcée présentait une fluorescence sensiblement inférieure à celle de la variante non renforcée correspondante.

a, Trois variantes différentes d'InvadeR ont été conçues. La variante 1 comprend les deux guanines d'initiation suivies de la séquence totalement complémentaire du brin fluorophore. Pour les variants 2 et 3, deux ou trois nucléotides supplémentaires ont été insérés entre les guanines initiatrices et la séquence InvadeR (régions grisées), de sorte qu'ils perturbent la structure secondaire à sa base. Des versions renforcées des variantes 2 et 3 ont été créées pour stabiliser la structure, tout en gardant le nombre et les positions des nucléotides insérés cohérents. Toutes les variantes ont le même nombre de nucléotides qui interagissent avec la porte du signal de l'ADN. Les énergies libres minimales et les probabilités d'appariement de bases pour chaque structure sont prédites à l'aide de NUPACK à 37 °C30. nts, ​​nucléotides. b, des variants InvadeR purifiés sur gel (5 µM) ont été ajoutés à une quantité équimolaire de la porte du signal d'ADN, et l'activation de la fluorescence a été quantifiée. La variante 3 génère le signal fluorescent le plus élevé suivi des variantes 2 et 1, tandis que les deux mutants de renforcement montrent une diminution du signal de leurs variantes respectives par la réduction de pli indiquée au-dessus des barres. c, lorsqu'une matrice d'ADN codant InvadeR est incluse avec T7 RNAP et la porte de signal d'ADN, la sortie d'ARN peut être suivie in situ en surveillant l'activation de la fluorescence à partir de la porte de signal. d, Comparaison de la cinétique de fluorescence des trois variantes d'IVT en utilisant une matrice d'ADN équimolaire (50 nM) ou un contrôle négatif sans matrice. e, f, Comparaison de la cinétique de fluorescence entre les variantes et leurs mutants de renforcement pour la variante 2 (e) et la variante 3 (f), montre que le renforcement des paires de bases a un impact négatif sur la cinétique de fluorescence. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous la forme d'un point (b) ou d'une ligne (d – f) avec une fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine µM). Chaque hauteur de barre dans b représente la moyenne sur ces répétitions. Les barres d'erreur (b) et l'ombrage (d–f) indiquent la moyenne des répétitions ± sd

Données source

Nous avons ensuite testé la cinétique de réaction TMSD des variants transcrits in situ. Lorsque 50 nM de la matrice d'ADN codant pour chaque variant InvadeR ont été ajoutés au mélange réactionnel IVT (Fig. 2c), nous avons observé l'activation de fluorescence la plus rapide à partir de la variante 3 suivie des variantes 2 et 1 (Fig. 2d), en accord avec l'expérience précédente. Nous avons également observé des réponses plus lentes des versions renforcées, réaffirmant notre hypothèse (Fig. 2e, f).

Cependant, nous avons observé des écarts entre les stabilités quantitatives prédites de la structure secondaire et la cinétique de la réaction. Plus précisément, les variantes renforcées avec des valeurs d'énergie libre minimales inférieures présentent une cinétique de réaction plus rapide et des valeurs de fluorescence au point final plus élevées que la variante 1 (Fig. 2d – f), en contradiction avec les résultats observés sur la Fig. 2b. Nous avons découvert que la variation de l'efficacité de la transcription T7 RNAP de chaque matrice d'ADN36 contribue à cet écart, bien que la structure secondaire de l'ARN ait un impact plus important sur la vitesse de réponse TMSD (Extended Data Fig. 2). Nous avons également constaté que l'ajout d'une séquence de terminaison T7 à la fin de la matrice d'ADN accélère la réaction, mais pas considérablement (Fig. 3 supplémentaire et données supplémentaires 3).

Ensemble, ces résultats montrent que l'intégration de considérations de structure secondaire et d'efficacité de transcription dans les principes de conception d'InvadeR peut être exploitée pour améliorer la vitesse de réaction.

Ensuite, nous avons déterminé si la transcription d'InvadeR peut être régulée avec un aTF pour créer un biocapteur sans cellule qui utilise les sorties TMSD. Cela nous a obligés à insérer une séquence opérateur aTF entre le promoteur T7 et la séquence InvadeR pour permettre la régulation de la transcription aTF. Nous avons précédemment démontré que l'espacement entre la séquence du promoteur T7 et la séquence de l'opérateur aTF est important pour une régulation efficace de l'IVT dans les réactions ROSALIND7,37. De même, nous avons constaté qu'un espaceur de 2 pb génère un signal TMSD robuste sans TetR, qui a été réduit à des niveaux proches de la ligne de base lorsqu'il est régulé par TetR (Fig. 3a, b).

a, les IVT peuvent être régulées allostériquement avec une matrice configurée pour lier un aTF purifié (TetR) via une séquence opérateur (tetO) placée en aval du promoteur T7. Une série d'espaceurs à des intervalles de 2 pb a été construite pour évaluer l'impact de la longueur de l'espaceur sur la capacité de TetR à réguler la transcription d'InvadeR. b, données de point final (à 1 h) présentées pour les variants d'espaceur promoteur-opérateur régulés (avec dimère TetR 5 μM, matrice d'ADN 50 nM) et non régulés (sans TetR). c, l'induction d'une réaction IVT régulée par TetR se produit en présence du ligand apparenté, aTc, qui se lie à TetR et empêche sa liaison à tetO. Cela permet à la transcription de se poursuivre, conduisant à l'activation de la fluorescence via TMSD. d, dose-réponse avec aTc, mesurée à 1 h avec une matrice d'ADN 50 nM et un dimère TetR 5 μM. La concentration de ligand la plus faible à laquelle le signal se distingue de l'arrière-plan a été déterminée à l'aide d'un test t de Student hétéroscédastique bilatéral par rapport à la condition sans ligand, et la plage de valeurs P est indiquée par des astérisques (*** P < 0, 001, ** P = 0, 001–0, 01, * P = 0, 01–0, 05, la valeur P exacte pour 5 µM aTc = 5, 064 × 10−5). Les valeurs P exactes ainsi que les degrés de liberté pour toutes les concentrations de ligand testées peuvent être trouvées dans les données sources. Les données pour la condition sans ligand ont été exclues car l'axe des x est sur l'échelle logarithmique et sont présentées dans les données source. e, La vitesse de sortie du TMSD est plus rapide que celle de la sortie de l'aptamère d'ARN. f, Comparaison de la cinétique de fluorescence entre les sorties InvadeR et aptamère régulées par TetR lorsqu'elles sont induites avec 10 μM d'aTc. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous la forme d'un point (b, d) ou d'une ligne (f) avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). Les barres d'erreur (d) et l'ombrage (f) indiquent la moyenne des répétitions ± sd

Données source

En utilisant l'espaceur de 2 pb, nous avons ensuite déterminé si TetR pouvait être déréprimé avec son ligand apparenté, l'anhydrotétracycline (aTc) pour permettre la transcription d'InvadeR (Fig. 3c). Lorsqu'une gamme de concentrations d'aTc a été ajoutée aux réactions IVT contenant chacune une matrice d'ADN 50 nM, un dimère TetR 5 µM et une porte de signal d'ADN 5 µM, nous avons observé une forte répression jusqu'à de faibles quantités micromolaires d'aTc, avec une induction semi-maximale entre 2, 5 et 5 µM d'aTc (Fig. 3d).

En raison de la vitesse rapide des réactions TMSD17, nous avons émis l'hypothèse que la vitesse d'induction médiée par le ligand de la sortie InvadeR serait beaucoup plus rapide que la sortie d'aptamère d'ARN ROSALIND précédemment utilisée qui est sujette à une liaison lente des chromophores et à un mauvais repliement34,38,39 (Fig. 3e). Comme prévu, nous avons observé que la plate-forme InvadeR active la fluorescence visible en ~ 10 min, ce qui est environ cinq fois plus rapide que la plate-forme d'aptamère d'ARN (Fig. 3f).

Dans l'ensemble, ces résultats démontrent qu'un biocapteur à base d'aTF peut être interfacé avec succès avec les sorties TMSD, conduisant à des améliorations immédiates de la vitesse de réaction.

Nous avons ensuite déterminé si le système est compatible avec différentes familles d'aTF pour détecter différentes classes de petites molécules. En plus de TetR, nous avons choisi TtgR40 et SmtB41 comme aTF représentatifs de la famille MarR42 et de la famille SmtB/ArsR43, respectivement. Nous avons placé la séquence opérateur apparentée de chaque aTF 2 pb en aval du promoteur T7 et immédiatement en amont des séquences InvadeR (Extended Data Fig. 3a – c). Lorsque la tétracycline a été utilisée pour induire des réactions régulées par TetR, nous avons observé un signal fluorescent fort et robuste visible en environ 10 min (données étendues Fig. 3d, g). De même, lorsque la naringénine, un ligand apparenté au TtgR, a été ajoutée aux réactions régulées par le TtgR, nous avons à nouveau observé une activation de fluorescence robuste uniquement en présence de naringénine (Extended Data Fig. 3e, h). Cependant, l'introduction de la séquence smtO a entraîné des vitesses de réaction beaucoup plus lentes, même dans des réactions non régulées (Extended Data Fig. 4c). Fait intéressant, la séquence smtO devrait former une forte épingle à cheveux avec la séquence InvadeR (Extended Data Fig. 4a), ce qui, sur la base de nos résultats sur la Fig. 2, pourrait avoir un impact sur les vitesses de réaction. Pour améliorer la cinétique de réaction, nous avons conçu un module d'isolation structurelle d'ARN pour empêcher le repliement intramoléculaire smtO: InvadeR (Extended Data Fig. 4), qui a montré une activation plus rapide du signal d'une réaction régulée par SmtB en présence de ZnSO4 avec un faible signal de fond (Extended Data Fig. 3f,i).

Ensemble, ces résultats démontrent que les stratégies de conception d'ARN peuvent être utilisées pour étendre de manière modulaire la plate-forme ROSALIND avec des circuits TMSD.

L'interface des biocapteurs acellulaires avec TMSD offre des possibilités de concevoir des dispositifs modulaires capables d'effectuer des tâches programmées en réponse à des entrées de petites molécules. Cela est particulièrement vrai parce que les circuits TMSD ont des règles de conception plus simples que les circuits protéiques44, il existe des modèles informatiques qui prédisent avec précision leur comportement34,35 et il existe un ensemble émergent d'outils de conception de circuits TMSD45,46. Nous avons donc exploité ces fonctionnalités pour créer une couche de traitement des informations TMSD pour ROSALIND.

Nous avons d'abord conçu et construit des portes logiques pour traiter deux ligands différents comme entrées du système. Plus précisément, nous avons adapté les conceptions précédentes de portes logiques TMSD, AND et OR, qui détectent les entrées d'acide nucléique12,14,15,46 (Fig. 4). Nous avons implémenté la logique OU en concevant des portes OU ADN qui agissent comme une couche intermédiaire entre InvadeR et la porte du signal. Une fois que la transcription d'InvadeR est déclenchée par un ligand chimique, InvadeR exécute TMSD sur sa porte OR d'ADN correspondante pour libérer un brin de sortie d'ADNss, qui peut ensuite envahir la porte de signal d'ADN pour produire un signal (Fig. 4a et données supplémentaires 4) 46. Les deux portes OR ADN partagent le même domaine de sortie (vert), mais sont activées par InvadeR régulé par deux aTF différents. L'inclusion de ces portes OU aux côtés des modèles d'ADN, des aTF et de la porte du signal a conduit à une génération de signal rapide, sauf en l'absence de ligands cibles (Fig. 4b et données supplémentaires 5). La modélisation de la porte OU à l'aide d'un ensemble d'équations différentielles ordinaires (ODE) décrivant les réactions IVT et TMSD (voir Informations supplémentaires pour plus de détails sur le modèle ODE utilisé) correspondait aux tendances expérimentales (Données étendues Fig. 5a et Données supplémentaires 6).

a, Une porte OU à deux entrées comprend deux portes OU ADN supplémentaires. Lorsque la transcription est activée par l'un ou l'autre des ligands, les brins InvadeR peuvent réagir avec leurs portes OU d'ADN respectives pour produire un brin de sortie avec un domaine (vert) qui peut envahir la porte du signal d'ADN. b, Lorsque la porte OU à deux entrées est activée par la tétracycline, le ZnSO4 ou les deux, une activation de la fluorescence est observée. c, Une porte ET à deux entrées contient une porte ET d'ADN qui nécessite que les deux brins InvadeR dissocient le brin de sortie pour révéler la prise complémentaire de la porte du signal. Des caractéristiques de conception telles que des pilotes thermodynamiques (surlignés en rouge) et un domaine de serrage sont mises en œuvre pour faciliter un TMSD efficace avec une fuite minimale (Extended Data Fig. 6). d, La porte ET à deux entrées active la fluorescence uniquement lorsque la tétracycline et le ZnSO4 sont présents. e, Une porte NOT comprend deux modèles d'ADN : un modèle InvadeR non régulé et un modèle d'inverseur régulé par aTF. Lors de la transcription, l'inverseur régulé par aTF forme une structure en épingle à cheveux qui ressemble à la porte du signal ADN pour créer une porte ARN NOT. InvadeR non régulé réagit de préférence avec la porte RNA NOT en raison d'un plus grand nombre d'interactions de paires de bases et d'un décalage de paires de bases avec la porte de signal ADN (rouge). Une séquence d'espacement est incluse pour empêcher la séquence tetO d'interférer avec la porte RNA NOT. f, lorsqu'elle est mise en œuvre avec un capteur de tétracycline, la porte NOT génère un signal en l'absence de tétracycline. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec une valeur de fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine μM). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± sd Les domaines de la même couleur partagent la même séquence sauf pour la porte ET où le domaine surligné en orange est modifié à partir du domaine orange dans la porte OU pour améliorer son efficacité TMSD. Toutes les portes d'acide nucléique sont dessinées selon les structures secondaires prédites à l'aide de NUPACK à 37 °C30. La séquence de chaque domaine et les concentrations de composants dans chaque porte peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 4 et 5, respectivement.

Données source

Ensuite, nous avons conçu une porte ET TMSD basée sur l'ARN en adaptant une conception de porte ET précédente47 qui se compose de trois domaines : le domaine 1 complémentaire d'InvadeR 1 (bleu), le domaine 2 complémentaire d'InvadeR 2 (orange) et le domaine 3 complémentaire de la porte de signal d'ADN (vert) (Fig. 4c et données supplémentaires 5). Les brins InvadeR ont été conçus pour avoir différentes séquences d'orteils afin de minimiser la liaison indésirable des orteils au domaine de porte ET incorrect. La mise en œuvre de cette architecture dans les réactions de détection utilisant TetR et SmtB n'a initialement conduit à aucune activation de fluorescence dans aucune condition (Extended Data Fig. 6b). Pour faire avancer les réactions TMSD, nous avons incorporé des discordances dans la porte ET qui agissent comme des moteurs thermodynamiques TMSD48 (Extended Data Fig. 6a). Bien que les pilotes thermodynamiques aient montré une activation du signal par InvadeR, une fuite substantielle a été observée avec la condition InvadeR 1 uniquement (Extended Data Fig. 6c). Pour réduire cette fuite, nous avons implémenté une caractéristique de conception supplémentaire appelée une pince dans le domaine 3 de la porte ET qui empêche le TMSD partiel en présence d'InvadeR 1 uniquement49. En augmentant la longueur de serrage à 7 pb, nous avons construit une porte ET qui nécessite à la fois des brins InvadeR inductibles à la tétracycline et au ZnSO4 pour la génération de signaux (Fig. 4d, Données étendues Figs. 5b et 6e et Données supplémentaires 5).

La construction de portes logiques plus complexes au-delà de AND et OR nécessite un circuit NOT, qui bloque le signal en présence d'un ligand cible. Pour réaliser l'inversion du signal, nous avons conçu une porte ARN NON capable de séquestrer InvadeR loin de la porte du signal ADN (Fig. 4e et données supplémentaires 4)47,50. Pour biaiser la liaison d'InvadeR à la porte ARN NOT, nous avons inclus trois caractéristiques de conception : (1) une prise plus longue sur la porte ARN NOT que sur la porte du signal ADN ; (2) un appariement de bases supplémentaire dans la boucle de la porte RNA NOT ; et (3) un décalage (surligné en rouge) entre InvadeR et la porte du signal ADN (Extended Data Fig. 6f – j). Nous avons également conçu une séquence d'espacement entre la porte ARN NOT et l'opérateur tetO pour isoler structurellement la séquence tetO de la séquence de porte NOT (Fig. 4e). Lorsque ces caractéristiques de conception ont été mises en œuvre, nous avons observé une réduction du signal en présence de tétracycline (Fig. 4f, Données étendues Fig. 5c et Données supplémentaires 5). Aucune inversion de signal n'a été observée à partir d'une matrice de contrôle dont la séquence est mélangée à partir de la porte NOT d'ARN inductible par la tétracycline (données étendues Fig. 7a, b). La même architecture de conception a été appliquée pour construire une porte NON d'ARN inductible par ZnSO4 (données étendues Figs. 5d, 6k – m et 7c, d, et données supplémentaires 4 et 5).

Ces résultats établissent un ensemble de règles de conception pour la construction de circuits TMSD en cascade pour un calcul de porte logique plus complexe.

Nous avons ensuite superposé les composants logiques de base pour effectuer des calculs logiques complexes, notamment NOR, NAND, IMPLY et NIMPLY.

Nous avons commencé par NOR - une inversion de la porte OR qui génère un signal uniquement lorsque toutes les entrées sont absentes - en combinant deux portes ARN NOT régulées chacune par TetR ou SmtB (Fig. 5a et Données supplémentaires 4). Avec les deux portes ARN NOT conçues pour séquestrer le même InvadeR exprimé de manière constitutive, nous avons observé l'activation de la fluorescence uniquement en l'absence des deux entrées de ligand (Fig. 5b, Données étendues Fig. 5e et Données supplémentaires 5).

a, Une porte NOR à deux entrées est construite en superposant deux portes ARN NOT. Les portes NOT sont régulées par TetR ou SmtB qui séquestrent les molécules InvadeR non régulées de la porte du signal d'ADN. b, L'activation de la fluorescence n'est observée qu'en l'absence des deux entrées. c, Une porte IMPLY à deux entrées combine une porte ADN OU avec une porte ARN NON. Dans cet exemple spécifique (ZnSO4 IMPLY tétracycline), la porte OU est régulée par TetR, et la porte NON est régulée par SmtB, empêchant la génération de signal en présence de ZnSO4 uniquement. d, l'activation de la fluorescence est observée à moins que seul ZnSO4 soit ajouté. Une génération de signal plus rapide est observée à partir de la condition d'entrée de tétracycline uniquement en raison de l'absence de décalage entre le brin de sortie de la porte OU et la porte du signal. e, Une porte NAND à deux entrées superpose deux portes ADN OU non régulées avec deux portes ARN NON régulées. Dans cette configuration, la présence des deux entrées est nécessaire pour gêner la génération du signal. Les pilotes thermodynamiques (surlignés en rouge) sont incorporés dans les portes NOT pour favoriser les interactions avec leurs brins InvadeR respectifs. f, le calcul de la porte NAND attendu est observé. g, Une porte NIMPLY à deux entrées est construite en combinant la porte ADN ET et la porte ARN PAS. Dans cet exemple spécifique, InvadeR induit par la tétracycline et InvadeR non régulé sont nécessaires pour l'activation de la porte ET. Une porte NON régulée par SmtB séquestre l'Envahisseur non régulé. h, L'activation de la fluorescence est observée en présence de tétracycline uniquement. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec une valeur de fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine μM). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± sd Les domaines de même couleur partagent la même séquence sauf pour la porte ET où le domaine surligné en orange est modifié à partir du domaine orange dans la porte OU. Toutes les portes d'acide nucléique sont dessinées selon les structures secondaires prédites à l'aide de NUPACK à 37 °C30. La séquence de chaque domaine et les concentrations de composants dans chaque porte peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 4 et 5, respectivement.

Données source

Ensuite, nous nous sommes concentrés sur l'architecture A IMPLY B, qui bloque le signal uniquement lorsque A est présent et B est absent. La porte de tétracycline ZnSO4 IMPLY a été construite en superposant la porte OU d'ADN induite par la tétracycline avec la porte NON d'ARN induite par ZnSO4 (Fig. 5c et données supplémentaires 4). Lorsqu'elle est mise en œuvre, la porte a généré un signal dans toutes les conditions d'entrée, sauf lorsque seul ZnSO4 est présent (Fig. 5d et Extended Data Fig. 5f). Nous notons, cependant, que l'incompatibilité intégrée entre InvadeR et la porte de signal (surlignée en rouge) a entraîné un signal fluorescent plus lent et plus faible à partir de la condition sans entrée ou des deux entrées qu'à partir de la condition de tétracycline uniquement, et des effets similaires ont été observés à partir de la porte tétracycline IMPLY ZnSO4 (données étendues Figs. 5g et 7e, f). Fait intéressant, les portes IMPLY peuvent également être construites sans la porte OR de l'ADN, ce qui permet des interactions directes entre le brin InvadeR induit par le ligand et la porte du signal (Extended Data Figs. 5h, i et 7g – j). La possibilité de concevoir des architectures de portes alternatives pour le même calcul logique met en évidence la modularité de la plate-forme.

Nous avons ensuite construit une porte NAND, qui combine les portes NOT et AND pour produire des signaux dans toutes les conditions sauf lorsque les deux entrées sont présentes. Nous avons exploré deux options de conception : (1) inversion d'un brin de sortie de porte ET (A NAND B = NOT (A AND B)) ; et (2) deux portes ARN NON intégrées dans l'architecture de la porte OU (NON (A ET B) = NON A OU NON B). En raison des contraintes de séquence imposées par la première option de conception, nous avons choisi de construire la porte NAND en utilisant la deuxième option (Fig. 5e). Cette conception implique quatre modèles d'ADN différents - deux modèles non régulés codant chacun pour InvadeR pour sa porte OR ADN correspondante et deux modèles régulés codant chacun pour la porte ARN NOT capable de séquestrer son InvadeR respectif. Pour éviter la cinétique de réaction TMSD plus lente observée dans la conception de la porte IMPLY, nous avons plutôt introduit un pilote thermodynamique dans la porte RNA NOT (surligné en rouge) pour favoriser le TMSD d'InvadeR avec la porte RNA NOT par rapport à celle avec la porte DNA OR (Fig. 5e). Une fois mis en œuvre, la tétracycline et le ZnSO4 étaient nécessaires pour empêcher la génération de signal (Fig. 5f et données étendues. Fig. 5j).

Enfin, nous avons conçu la porte A NIMPLY B, qui combine les portes ET et NON pour produire une sortie uniquement lorsque l'entrée A est présente seule. La conception spécifique de la porte NIMPLY illustrée à la Fig. 5g utilise la porte ARN NOT induite par ZnSO4 à côté d'une porte ADN ET qui nécessite à la fois InvadeR non régulé et InvadeR induit par la tétracycline pour l'activation. La porte de tétracycline ZnSO4 NIMPLY ainsi que la porte de tétracycline NIMPLY ZnSO4 ont effectué les calculs de porte logique attendus (Fig. 5h et Extended Data Figs. 5k, 1 et 7k).

Ensemble, ces résultats montrent que les composants de base de la porte logique peuvent être superposés pour effectuer des calculs moléculaires plus complexes en utilisant de petites molécules comme entrées du système.

Pour démontrer une application pratique du traitement de l'information TMSD, nous nous sommes ensuite concentrés sur la quantification des sorties de biocapteurs. Dans les systèmes de biodétection acellulaires typiques, les sorties sont générées lorsque la concentration du composé d'entrée est supérieure à un seuil de détection, créant une interprétation des résultats de « présence/absence » adaptée à ce seuil51. Ce seuil de détection est déterminé par les constantes de liaison aTF-ligand et aTF-ADN, qui peuvent être difficiles à régler. Pour remédier à cette limitation, nous avons conçu un système comme un circuit ADC52 pour créer une série de sorties binaires qui codent la concentration d'entrée analogique du composé cible (Fig. 4 supplémentaire).

Pour construire un circuit ADC génétique, nous avons d'abord créé un circuit comparateur - un bloc de construction d'ADC qui produit une sortie binaire "vraie" lorsque l'entrée est supérieure à un seuil prédéfini. Le seuillage est possible dans le TMSD car la cinétique de la réaction peut être augmentée avec précision en allongeant les régions de maintien de la porte de l'ADN17 (Fig. 6a). En utilisant cette fonctionnalité, nous avons construit une porte de seuil d'ADN non marquée qui partage la même séquence avec la porte de signal d'ADN mais avec une prise plus longue de huit nucléotides (Fig. 6a). Étant donné que le signal ne doit être activé qu'après que la porte de seuil est complètement consommée, nous avons estimé qu'en ajustant la quantité de porte de seuil, nous pouvons contrôler avec précision le moment auquel InvadeR active la fluorescence à partir de la porte de signal. La modélisation de ce comportement cinétique a montré qu'il s'agissait bien du comportement prédit de la configuration, et nous avons observé expérimentalement un accord quantitatif avec les prédictions de modélisation (Fig. 6b). De cette manière, une réaction TMSD seuillée agit comme un circuit comparateur «cinétique» - pour une entrée donnée, le moment auquel la génération du signal se produit est proportionnel à la quantité de la porte de seuil.

a, l'augmentation de la longueur de la région d'orteil de la porte de l'ADN peut être utilisée pour accélérer le processus d'invasion des brins. Une porte d'ADN non marquée avec une prise plus longue (huit nucléotides) peut alors réagir préférentiellement avec InvadeR, agissant comme un seuil programmable. InvadeR ne peut déplacer le brin de la porte du signal (prise de quatre nucléotides) qu'après l'épuisement de la porte du seuil. b, Le titrage de la porte de seuil d'orteil à huit nucléotides dans différents rapports au-dessus d'une concentration de porte de signal fixe (0–8 ×) entraîne un retard dans l'activation de la fluorescence qui peut être modélisé quantitativement avec des simulations ODE (lignes pointillées). Toutes les données présentées pour n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous forme de ligne. Les valeurs de fluorescence brutes ont d'abord été normalisées au MEF (fluorescéine μM) et normalisées au MEF maximum parmi toutes les conditions pour permettre leur comparaison avec les simulations (voir Méthodes pour la méthode de normalisation utilisée). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± sd c, Un circuit ADC moléculaire est réalisé en construisant une bande de tests du même capteur, chaque test contenant une concentration différente de la porte de seuil d'ADN. Une concentration de grille de seuil plus élevée nécessite une concentration de ligand plus élevée pour activer la fluorescence. Lorsque le même échantillon est appliqué à chaque tube, un utilisateur peut obtenir des informations semi-quantitatives sur la concentration de ligand présent dans l'échantillon (entrée analogique) en identifiant la série de tubes qui s'activent (sortie numérique binaire). Ici, nous définissons un tube avec sa valeur MEF> 0,5 comme "ON" car le seuil visible se situe autour de la valeur indiquée. d, e, Caractérisation d'un circuit ADC moléculaire pour le zinc à l'aide de simulations ODE (d) et de données expérimentales de point final à 100 min (e) générées à l'aide du capteur de zinc régulé par SmtB. Les valeurs sur la carte thermique représentent le MEF moyen (μM de fluorescéine) de n = 3 réplicats biologiques indépendants (voir Extended Data Fig. 8 pour toutes les données).

Données source

Ensuite, nous avons créé une série de circuits comparateurs TMSD de biodétection pour agir comme un ADC pour la concentration de ligand en préparant une série de réactions dans lesquelles chaque tube contient une quantité différente de la porte de seuil. En ajoutant la même concentration de ligand à chaque tube, un utilisateur peut observer quels tubes de la série sont activés à un moment précis et obtenir des informations semi-quantitatives sur la concentration de ligand (Fig. 6c). Nous avons testé la faisabilité de l'approche en utilisant le même ensemble d'ODE utilisé sur la figure 6b avec l'ajout de la cinétique de liaison aTF-ADN et aTF-ligand, en nous concentrant sur la détection du zinc en raison de sa pertinence dans les approvisionnements en eau municipaux53. À l'aide de simulations de modélisation, nous avons déterminé les concentrations seuils de grille nécessaires pour activer un, deux, trois ou quatre tubes après 100 min correspondant à des concentrations de zinc de 2, 3, 5, 5 et 10 µM, respectivement (Fig. 6d). Nous avons ensuite construit le circuit ADC génétique correspondant avec les réactions TMSD régulées par SmtB et avons observé le schéma de signaux attendu après 100 min, où le nombre de tubes activés dans la série augmentait avec des concentrations de ZnSO4 d'entrée plus élevées (Fig. 6e et Données étendues Fig. 8a – d). Cette mise en œuvre permet à un utilisateur de déterminer la plage de concentration de zinc d'entrée en lisant directement la séquence de tubes activés.

Nous pensons que cette démonstration représente le potentiel des circuits TMSD à agir comme une couche de traitement de l'information de biocapteurs sans cellule qui augmentent la facilité d'interprétation et le contenu informatif des signaux de sortie.

Dans cette étude, nous montrons que les circuits TMSD peuvent être interfacés avec IVT pour agir comme une couche de traitement de l'information pour les biocapteurs acellulaires. La vitesse des sorties TMSD a conduit à une amélioration substantielle de la vitesse de génération du signal, avec moins de 10 minutes de temps de détection (Fig. 3f). Plus important encore, nous avons constaté que la nature simple et définie de ROSALIND, combinée à la puissance de calcul de TMSD, nous a permis de superposer plusieurs portes ARN-ADN pour construire 12 circuits différents qui implémentent sept fonctions logiques différentes de manière modulaire (Figs. 4 et 5). Exploitant cette haute programmabilité de la plate-forme, nous avons également conçu et validé un circuit capable d'estimer la plage de concentration d'un composé cible inconnu dans un échantillon (Fig. 6). Enfin, cette plate-forme se prête à la lyophilisation (Extended Data Fig. 9) et peut fonctionner avec des matrices d'échantillons du monde réel non traitées (Extended Data Fig. 10).

Le système présentait un certain nombre de défis de conception, notamment l'incompatibilité des orteils 3 'dans les portes d'ADN avec les réactions IVT pilotées par T7 RNAP (Extended Data Fig. 1) 45, des structures secondaires d'ARN interférentes pouvant ralentir le TMSD (Fig. 2 et Extended Data Fig. 4) et une efficacité de transcription T7 variable de différents modèles d'ADN36 (Extended Data Fig. 2). Ces défis ont fourni des opportunités de développer des principes de conception de TMSD basés sur l'ARN qui, selon nous, peuvent être généralisés à d'autres systèmes d'ingénierie d'acide nucléique (Fig. 5 supplémentaire).

L'une des principales limites de la plateforme est son coût. Les oligos chimiquement modifiés avec purification peuvent coûter environ 100 USD ou plus, bien qu'un seul lot puisse être utilisé pour effectuer des centaines de réactions. En outre, les portes d'ADN doivent souvent être purifiées sur gel après l'hybridation pour éliminer tous les brins d'ADNsb non liés, ce qui peut prendre beaucoup de temps et être laborieux. Nous notons, cependant, que le coût des colorants chimiques pour les systèmes de rapport d'aptamère d'ARN activant la fluorescence n'est pas négligeable, et les avantages fournis par le système TMSD, tels que la vitesse de réponse améliorée et la puissance de calcul, dépassent ses limites.

La principale caractéristique de cette étude a été de démontrer le potentiel des circuits TMSD pour étendre la fonction des biocapteurs sans cellule en agissant comme des couches de traitement de l'information. Alors qu'une approche a été récemment développée pour interfacer la biodétection basée sur l'aTF avec le TMSD via des cascades de TMSD médiées par des endonucléases54, aucun calcul moléculaire programmable au-delà de la simple détection de contaminants n'a été présenté. À titre de démonstration, nous avons modélisé, conçu et validé plusieurs circuits TMSD à base d'ARN en couches capables d'effectuer un calcul de porte logique complexe avec des entrées de petites molécules en adaptant plusieurs éléments de portes logiques TMSD à base d'ADN (Figs. 4 et 5, et Données étendues Figs. 5–7). Bien que non représentés, des circuits logiques plus complexes tels que XOR et XNOR pourraient être conçus en superposant des portes supplémentaires.

Pour mettre davantage en évidence la capacité de la plate-forme pour le traitement de l'information, nous avons développé un circuit ADC génétique qui peut être utilisé pour estimer une concentration de ligand d'entrée à un niveau semi-quantitatif (Fig. 6). En particulier, ce circuit utilise un calcul de seuillage pour convertir un signal analogique d'une concentration de molécules d'entrée en une sortie numérique du nombre de tubes activés. Ce développement a été rendu possible par la capacité d'ajuster avec précision les taux de réaction du TMSD sur la base de la longueur du pied. Nous notons cependant que ce circuit ADC génétique est différent d'un circuit ADC électrique en ce que son résultat dépend du temps d'activation et non du niveau d'activation, car le circuit repose sur une cinétique de réaction de seuillage plutôt que sur des concentrations strictement d'entrée. En conséquence, cette stratégie est la mieux adaptée pour distinguer les concentrations de ligand qui entraînent des différences dans la cinétique de sortie (Extended Data Fig. 8e – g).

Nous pensons que cette plate-forme ouvre la porte à d'autres types de calcul moléculaire dans les systèmes acellulaires. Par exemple, un circuit d'amplification tel qu'un ensemble en épingle à cheveux catalytique55 pourrait être appliqué à ROSALIND avec TMSD pour amplifier les signaux et rendre un capteur ultrasensible. Au-delà du seuillage, d'autres opérations démontrées dans les architectures de porte à bascule ADN pourraient être portées sur cette plate-forme pour divers calculs46. Plus précisément, les portes logiques peuvent être étendues pour développer une stratégie générale pour corriger la promiscuité du ligand aTF7. De plus, étant donné que pratiquement n'importe quel aTF qui fonctionne dans un contexte in vitro peut être utilisé7, plusieurs portes d'ADN avec différents rapporteurs pourraient être ajoutées pour le multiplexage. Le rôle fondamental que jouent les circuits ADC dans l'interfaçage des circuits électroniques analogiques et numériques est également prometteur pour l'adoption de conceptions de circuits électroniques supplémentaires pour les réactions biochimiques.

Ensemble, ces résultats montrent que l'établissement d'une interface entre la biodétection de petites molécules et les circuits TMSD est une première étape prometteuse vers la création d'une plate-forme générale de calcul moléculaire pour améliorer et étendre la fonction des technologies de biodétection sans cellule.

La souche K12 d'Escherichia coli (NEB Turbo Competent E. coli, New England Biolabs, catalogue n° C2984) a été utilisée pour le clonage de routine. La souche E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS (Novagen, catalogue n° 71401) a été utilisée pour l'expression de la protéine recombinante. Le bouillon Luria additionné du ou des antibiotiques appropriés (100 µg ml-1 de carbénicilline, 100 µg ml-1 de kanamycine et/ou 34 µg ml-1 de chloramphénicol) a été utilisé comme milieu de croissance.

Les portes de signal d'ADN utilisées dans cette étude ont été synthétisées par des technologies d'ADN intégrées sous forme d'oligos modifiés. Ils ont été générés en dénaturant un oligonucléotide modifié par la 6-carboxyfluorescéine (6-FAM) et l'oligonucléotide modifié complémentaire Iowa Black FQ quencher (Données supplémentaires 1) à 95 ° C séparément pendant 3 min et refroidissement lent (-0, 1 ° C s-1) à température ambiante dans un tampon de recuit (acétate de potassium 100 mM et HEPES 30 mM, pH 8, 0). Les oligonucléotides recuits ont ensuite été purifiés en les résolvant sur des gels natifs PAGE – Tris-Borate-EDTA (TBE) à 20 %, en isolant la bande de taille attendue et en éluant à 4 ° C pendant la nuit dans un tampon de recuit. La porte d'ADN éluée a ensuite été précipitée à l'éthanol, remise en suspension dans de l'H2O ultrapure MilliQ et la concentration quantifiée à l'aide du spectrophotomètre UV-Vis à microvolume Thermo Scientific NanoDrop One. Les portes d'ADN utilisées dans les Fig. 4–6 et Extended Data Fig. 6 et 7 ont été préparés en utilisant la même méthode mais en annelant deux oligonucléotides complémentaires sans aucune modification.

Les oligonucléotides d'ADN pour le clonage et le séquençage ont été synthétisés par Integrated DNA Technologies. Les gènes codant pour les aTF ont été synthétisés sous forme de gBlocks (Integrated DNA Technologies) ou de fragments de gènes (Twist Bioscience). Les plasmides d'expression protéique ont été clonés à l'aide de Gibson Assembly (NEB Gibson Assembly Master Mix, New England Biolabs, n° de catalogue E2611) dans un squelette de plasmide pET-28c et ont été conçus pour surexprimer les protéines recombinantes sous forme de fusions marquées His C-terminal. Une construction pour exprimer SmtB incorporait en outre une séquence de reconnaissance pour le clivage et l'élimination de l'étiquette His à l'aide de la protéase TEV. Les constructions assemblées de Gibson ont été transformées dans des cellules NEB Turbo, et les colonies isolées ont été purifiées pour l'ADN plasmidique (QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen, catalogue n° 27106). Les séquences plasmidiques ont été vérifiées avec le séquençage de l'ADN Sanger (Quintara Biosciences) en utilisant les amorces répertoriées dans les données supplémentaires 1.

Tous les modèles de transcription ont été générés à l'aide de l'une des deux méthodes : (1) amplification par PCR (kit Phusion High-Fidelity PCR, New England Biolabs, catalogue n° E0553) d'un oligo qui comprend un promoteur T7, un site opérateur aTF facultatif, la séquence codante InvadeR et un terminateur T7 facultatif à l'aide des ensembles d'amorces ; ou (2) l'annelage de deux oligonucléotides complémentaires qui incluent un promoteur T7, un site opérateur aTF facultatif, les séquences codant pour la porte InvadeR ou RNA NOT. Tous les oligos et ensembles d'amorces utilisés dans cette étude sont répertoriés dans les données supplémentaires 1. Ici, nous définissons le promoteur T7 comme une séquence minimale de 17 pb (TAATACGACTCACTATA) à l'exclusion du premier G qui est transcrit. Les matrices amplifiées par PCR ont été purifiées (kit de purification QIAquick PCR, Qiagen, catalogue n° 28106) et vérifiées pour la présence d'une seule bande d'ADN de taille attendue sur un gel Tris-Acétate-EDTA-agarose à 2 %. Les matrices générées par l'annelage de deux oligos complémentaires ont été préparées et purifiées en utilisant la même méthode décrite dans « DNA gate preparation ». Les concentrations de toutes les matrices d'ADN ont été déterminées à l'aide du kit de test Qubit dsDNA BR Assay (Invitrogen, n° de catalogue Q32853).

Tous les plasmides et matrices d'ADN ont été stockés à 4 ° C jusqu'à leur utilisation. Une feuille de calcul répertoriant les séquences et les numéros d'accès Addgene de tous les plasmides et oligos générés dans cette étude sont répertoriés dans les données supplémentaires 1.

Les variants d'InvadeR utilisés pour les essais de liaison d'oligo purifiés ont d'abord été exprimés par une IVT d'une nuit à 37 °C à partir d'une matrice de transcription codant pour un ribozyme de l'hépatite D à clivage cis à l'extrémité 3' de la séquence d'InvadeR avec les composants suivants : tampon IVT (40 mM Tris-HCl pH 8, 8 mM MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 20 mM de NaCl et 2 mM de spermidine ), NTP 11,4 mM pH 7,5, 0,3 unité (U) de pyrophosphatase inorganique thermostable (New England Biolabs, catalogue n° M0296S), matrice de transcription 100 nM, 50 ng de T7 RNAP et MilliQ ultrapure H2O pour un volume total de 500 µl. Les réactions IVT pendant la nuit ont ensuite été précipitées à l'éthanol et purifiées en les résolvant sur un gel à 20% d'urée-PAGE-TBE, en isolant la bande de taille attendue (26-29 nucléotides) et en éluant à 4 ° C pendant la nuit dans MilliQ ultrapure H2O. Les variantes d'InvadeR éluées ont été précipitées à l'éthanol, remises en suspension dans de l'H2O ultrapure MilliQ, quantifiées à l'aide du kit de test Qubit RNA BR (Invitrogen, n° de catalogue Q10211) et stockées à –20 °C jusqu'à leur utilisation. La séquence de ribozyme de l'hépatite D utilisée se trouve dans les données supplémentaires 1.

Les aTF ont été exprimés et purifiés comme décrit précédemment7. En bref, des plasmides pET-28c à séquence vérifiée ont été transformés dans la souche Rosetta 2(DE3)pLysS E. coli. Des cultures cellulaires (1 à 2 L) ont été cultivées dans du bouillon Luria à 37 ° C, induites avec 0, 5 mM d'isopropyl-β-d-thiogalactoside à une densité optique (600 nm) d'environ 0, 5 et cultivées pendant 4 h supplémentaires à 37 ° C. Les cultures ont ensuite été culottées par centrifugation et ont été soit stockées à -80 ° C, soit remises en suspension dans un tampon de lyse (10 mM Tris – HCl pH 8, 500 mM NaCl, 1 mM Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) et inhibiteur de protéase (Complete EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail, Roche)) pour purification. Les cellules remises en suspension ont ensuite été lysées sur de la glace par ultrasons et les matériaux insolubles ont été éliminés par centrifugation. Le surnageant clarifié contenant le TetR a ensuite été purifié par chromatographie d'affinité His-tag avec une colonne Ni-NTA (colonne HisTrap FF 5 ml, GE Healthcare Life Sciences) suivie d'une chromatographie d'exclusion de taille (colonne Superdex HiLoad 26/600 200 pg, GE Healthcare Life Sciences) à l'aide d'un système de chromatographie liquide rapide pour protéines AKTAxpress. Les surnageants clarifiés contenant TtgR et SmtB ont été purifiés en utilisant une chromatographie d'affinité His-tag avec une colonne de gravité chargée de Ni-NTA Agarose (Qiagen, catalogue n° 30210). Les fractions éluées de la chromatographie liquide rapide sur protéines (pour TetR) ou de la colonne de gravité (pour TtgR et SmtB) ont été concentrées et échangées avec du tampon (25 mM Tris – HCl, 100 mM NaCl, 1 mM TCEP, 50% glycérol v / v) en utilisant une filtration centrifuge (Amicon Ultra-0.5, Millipore Sigma). Les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide du kit d'analyse de protéines Qubit (Invitrogen, n° de catalogue Q33212). La pureté et la taille des protéines ont été validées sur gel SDS-PAGE (cellule Mini-PROTEAN TGX et Mini-TETRA, Bio-Rad). Les protéines purifiées ont été conservées à –20 °C.

Des réactions IVT maison ont été mises en place en ajoutant les composants suivants listés à leur concentration finale : tampon IVT (Tris-HCl 40 mM pH 8, MgCl2 8 mM, dithiothréitol 10 mM, NaCl 20 mM et spermidine 2 mM), NTP 11,4 mM pH 7,5, 0,3 U de pyrophosphatase inorganique thermostable (New England Biolabs, catalogue n° M0296S), matrice de transcription , porte(s) ADN et H2O ultrapure MilliQ jusqu'à un volume total de 20 µl. Les réactions IVT régulées comprenaient en outre un aTF purifié à la concentration indiquée et ont été équilibrées à 37 ° C pendant environ 10 min. Immédiatement avant les mesures du lecteur de plaque, 2 ng de T7 RNAP et, éventuellement, un ligand à la concentration indiquée ont été ajoutés à la réaction. Les réactions ont ensuite été caractérisées sur un lecteur de plaques comme décrit dans « Quantification du lecteur de plaques et standardisation de la fluorescéine équivalente micromolaire ».

Pour les produits d'ARN présentés sur les images de gel des Fig. 1c, f et 2c, les réactions IVT ont d'abord été mises en place comme décrit ci-dessus. Ensuite, une extraction au phénol-chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol a été effectuée pour éliminer toutes les protéines. Les réactions ont ensuite été réhydratées dans un tampon TURBO DNase 1X avec 2 U de TURBO DNase (Invitrogen, n° de catalogue QAM2238) jusqu'à un volume total de 20 µl et incubées à 37 °C pendant 30 min pour éliminer les portes ADN et les matrices de transcription. Une extraction au phénol-chloroforme suivie d'une précipitation à l'éthanol a été effectuée à nouveau pour éliminer la DNase et réhydratée dans de l'H2O ultrapure MilliQ. Les concentrations des produits d'ARN extraits ont été mesurées à l'aide du kit de test Qubit RNA HS (Invitrogen, catalogue n° Q32852) et conservées à -20 °C jusqu'à une analyse plus approfondie telle que PAGE. Pour l'analyse PAGE de ces produits d'ARN extraits, des gels à 20% d'urée-PAGE-TBE ont été utilisés et les gels ont été imagés à l'aide d'un système d'imagerie ChemiDoc Touch Gel (logiciel Bio-Rad Image Lab Touch v.1.2.0.12).

Avant la lyophilisation, les bouchons des tubes PCR ont été percés avec une épingle pour créer trois trous. La lyophilisation des réactions ROSALIND a ensuite été réalisée en assemblant les composants de l'IVT (ci-dessus) avec l'ajout de 50 mM de saccharose et de 250 mM de d-mannitol. Les tubes de réaction assemblés ont été immédiatement transférés dans un bloc d'aluminium prérefroidi et placés dans un congélateur à -80 ° C pendant 10 min pour permettre une congélation lente. Après la congélation lente, les tubes de réaction ont été enveloppés dans des Kimwipes et du papier d'aluminium, immergés dans de l'azote liquide, puis transférés dans un système FreeZone 2,5 L Bench Top Freeze Dry (Labconco) pour une lyophilisation pendant la nuit avec une température de condenseur de -85 ° C et une pression de 0,04 mbar. Sauf réhydratation immédiate, les réactions lyophilisées ont été conditionnées comme suit. Les réactions ont été placées dans un sac scellable sous vide avec un déshydratant (Dri-Card Desiccants, Uline, n° de catalogue S-19582), purgées avec de l'argon à l'aide d'une cartouche d'argon (ArT Wine Preserver, Amazon, n° de catalogue 8541977939) et immédiatement scellées sous vide (KOIOS Vacuum Sealer Machine, Amazon, n° de catalogue TVS-2233). Le sac scellé sous vide a ensuite été placé dans un sac de protection contre la lumière (sacs alimentaires ouverts Mylar, Uline, n° de catalogue S-11661), thermoscellé (Metronic 8 pouces Impulse Bag Sealer, Amazon, n° de catalogue 8541949845) et stocké dans un endroit frais et ombragé jusqu'à utilisation.

Un étalon traçable du National Institute of Standards and Technology (Invitrogen, catalogue n° F36915) a été utilisé pour convertir les mesures de fluorescence arbitraires en fluorescéine équivalente micromolaire (MEF). Des dilutions en série à partir d'un stock de 50 µM ont été préparées dans un tampon borate de sodium 100 mM à pH 9,5, y compris un blanc de tampon borate de sodium 100 mM (total de 12 échantillons). Pour chaque concentration, neuf répliques d'échantillons ont été créées par lots de trois, et les valeurs de fluorescence ont été lues à une longueur d'onde d'excitation de 495 nm et une longueur d'onde d'émission de 520 nm pour la fluorescence activée par la 6-FAM (fluorescéine), ou à une longueur d'onde d'excitation de 472 nm et une longueur d'onde d'émission de 507 nm pour la fluorescence activée par le brocoli dimérique à jonction 3 voies (3WJdB) sur un lecteur de plaque (Synergy H1, BioTek Gen 5 v.2.04). Les valeurs de fluorescence pour une concentration de fluorescéine dans laquelle un seul réplicat a saturé le lecteur de plaque ont été exclues de l'analyse. Les répliques restantes (neuf par échantillon) ont ensuite été moyennées à chaque concentration de fluorescéine, et la valeur de fluorescence moyenne du blanc a été soustraite de toutes les valeurs. Une régression linéaire a ensuite été effectuée pour les concentrations dans la plage linéaire de fluorescence (fluorescéine de 0 à 3,125 µM) entre les valeurs de fluorescence mesurées en unités arbitraires et la concentration de fluorescéine pour identifier le facteur de conversion. Pour chaque lecteur de plaque, réglage d'excitation, d'émission et de gain, nous avons trouvé un facteur de conversion linéaire qui a été utilisé pour corréler les valeurs de fluorescence arbitraires au MEF (Fig. 1 supplémentaire et données supplémentaires 3).

Pour la caractérisation, 19 µl de réactions ont été chargés sur une plaque à fond plat optiquement transparente de 384 puits à l'aide d'une pipette multicanaux, recouverte d'un joint de plaque et mesurée sur un lecteur de plaque (Synergy H1, BioTek Gen5 v.2.04). L'analyse cinétique de la fluorescence activée par le 6-FAM (fluorescéine) a été réalisée en lisant la plaque à des intervalles de 1 min avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 495 et 520 nm, respectivement, pendant 2 h à 37 ° C. L'analyse cinétique de la fluorescence activée par 3WJdB a été réalisée en lisant la plaque à des intervalles de 3 minutes avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 472 et 507 nm, respectivement, pendant 4 h à 37 ° C. Les valeurs de fluorescence arbitraires ont ensuite été converties en MEF en divisant par le facteur de conversion d'étalonnage approprié.

À l'exception des données de la figure 6b, aucune soustraction de fond n'a été effectuée lors de l'analyse des sorties d'une réaction. Un exemple de cette procédure de normalisation est illustré à la Fig. 1 supplémentaire.

Les données présentées sur la figure 6b ont été générées comme ci-dessus, puis normalisées à l'aide de la méthode suivante pour comparer les observations expérimentales avec les simulations ODE. Les valeurs de fluorescence brutes ont d'abord été normalisées en MEF (fluorescéine µM) en utilisant la méthode décrite ci-dessus. La valeur maximale de MEF a ensuite été déterminée parmi toutes les réactions exécutées (5 conditions × 3 répétitions = 15 réactions). Chaque valeur MEF à chaque intervalle de temps a ensuite été normalisée à l'aide de la formule suivante :

La soustraction de fond a été effectuée pour tenir compte de la fluorescence non nulle observée pour la porte de signal d'ADN désactivée. Une fois que toutes les données ont été normalisées selon la formule ci-dessus, n = 3 répétitions par condition ont été moyennées et la valeur d'écart type correspondante par condition a été calculée.

Images de gel non recadrées et non traitées présentées dans la Fig. 2d supplémentaire et les Figs de données étendues. 1c,f et 2c sont disponibles soit en tant que données source, soit en tant que données supplémentaires 2 et déposées dans Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/hr3j3yztxb.1). L'intensité de la bande d'un gel d'urée-PAGE teinté d'or SYBR dans Extended Data Fig. 2c a été calculée avec Fiji-ImageJ en utilisant la méthode traditionnelle de profil de voie comme décrit précédemment56. En bref, une région d'intérêt dans chaque voie a été enregistrée en utilisant un rectangle de mêmes dimensions. Le fond irrégulier a ensuite été pris en compte en traçant une ligne droite au bas de chaque pic, et la zone de pic dans chaque voie a été calculée à l'aide de l'outil baguette. Les aires de pic de l'étalon d'ARN ont ensuite été tracées par rapport aux quantités totales chargées pour créer la courbe standard dans Extended Data Fig. 2d (plage linéaire : 0, 25 à 2 ng). En utilisant le facteur de conversion de la courbe standard, les concentrations de variants d'InvadeR ont été estimées à partir des valeurs de surface de pic obtenues à partir de l'outil baguette.

Pour l'eau du robinet enrichie en ZnSO4 d'Evanston, IL, deux bouteilles contenant environ 50 ml d'échantillons d'eau ont été prélevées dans une fontaine à eau. L'une des bouteilles a ensuite été filtrée à 0,22 µm à l'aide d'un système de filtration sous vide stérile Steriflip-GP (Millipore Sigma, n° de catalogue SCGP00525). Les échantillons d'eau filtrée et non filtrée ont été enrichis en utilisant une solution de ZnSO4 10, 1 ou 0,1 mM qui a été diluée à partir de la solution mère de ZnSO4 2 M (Sigma, catalogue n° 83265). Lors de la réhydratation, des mesures de fluorescence des réactions ont été effectuées à l'aide d'un lecteur de plaque (voir « Quantification du lecteur de plaque et standardisation MEF »). Pour l'eau du lac Michigan enrichie en ZnSO4 d'Evanston, IL, la même méthode d'échantillonnage a été appliquée.

Les ODE pour chaque espèce de réactif ont été dérivées à l'aide de la cinétique de réaction de liaison aTF, IVT et TMSD. Les ODE ont été calculés à l'aide d'une fonction de solveur ODE, odeint du package Scipy.Integrate dans Python v.3.7.6. Les paramètres cinétiques ont été estimés à partir de la littérature, et les conditions initiales ont été fixées aux conditions expérimentales, avec des espèces intermédiaires fixées à zéro. Les détails des simulations ODE sont discutés dans les informations supplémentaires.

Le nombre de répétitions et les types de répétitions effectuées sont décrits dans la légende de chaque figure. Les points de données individuels sont affichés et, le cas échéant, la moyenne ± sd est indiquée ; cette information est fournie dans la légende de chaque figure. Le type d'analyse statistique effectuée à la Fig. 3d et à la Fig. 3 des données étendues est décrit dans la légende de chaque figure. Les valeurs P exactes ainsi que les degrés de liberté calculés à partir de l'analyse statistique peuvent être trouvés dans les données sources.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données présentées dans cet article sont disponibles sous forme de données sources et de données supplémentaires. Toutes les données sources ainsi que les données supplémentaires 2 et 3 sont également déposées dans Mendeley Data (doi : 10.17632/hr3j3yztxb.1)57. Tous les plasmides utilisés dans cet article sont disponibles dans Addgene avec les identifiants 140371, 140374, 140391 et 140395. Les données sources sont fournies avec cet article.

Les fichiers Jupyter Notebook avec les codes Python utilisés dans Extended Data Fig. 5, Extended Data Fig. 8 et Fig. 6 sont fournis en tant que données supplémentaires 6, et le modèle ODE utilisé dans cet article est décrit dans les informations supplémentaires. Les codes Python sont également disponibles dans GitHub à https://git.io/Jtlh1 (réf. 58).

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Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK Lucks, JB Programmation de biocapteurs sans cellule avec des circuits de déplacement de brin d'ADN. GitHub https://git.io/Jtlh1 (2021).

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Nous remercions A. Thompson (Northwestern University) et C. Knopp (Northwestern University) pour la gestion des réactifs expérimentaux et de l'équipement utilisé dans cette étude; J. Hester (Northwestern University), A. Curtiss (Northwestern University) et J. Mamish (Northwestern University) pour une discussion utile sur l'architecture du circuit ADC ; S. Schaffter (National Institute of Standards and Technology) pour l'édition du manuscrit et une discussion utile sur les circuits TMSD ; J. Peruzzi (Northwestern University) pour son aide dans les mesures NanoDrop ; S. Pshenychnyi (Recombinant Protein Production Core at Northwestern University) pour son aide dans la purification des protéines. JKJ a été soutenu en partie par le groupe d'études supérieures en biotechnologie, système et biologie synthétique de l'Université Northwestern, qui est affilié au programme de formation en biotechnologie, par une bourse Ryan et par une bourse de fin d'année de la McCormick School of Engineering. L'AMC a été soutenue par le ministère de la Défense dans le cadre du programme de bourses d'études supérieures en sciences et en génie de la Défense nationale (NDSEG). Ce travail a également été soutenu par le financement de NSF CAREER (1452441 à JBL), NSF MCB RAPID (1929912 à JBL), le soutien du Crown Family Center for Jewish and Israel Studies de la Northwestern University (à JBL) et Searle Funds au Chicago Community Trust (à JBL).

Département de génie chimique et biologique, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta & Julius B. Lucks

Centre de biologie synthétique, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta & Julius B. Lucks

Centre de recherche sur l'eau, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Jaeyoung K. Jung, Chloé M. Archuleta & Julius B. Lucks

Stemloop, Inc., Evanston, Illinois, États-Unis

Khalid K. Alam & Julius B. Chances

Programme interdisciplinaire d'études supérieures en sciences biologiques, Northwestern University, Evanston, Illinois, États-Unis

Julius B. Chances

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JKJ, KKA et JBL ont conçu l'étude. JKJ, CMA et JBL ont analysé les données. JKJ, CMA et KKA ont mené la recherche. JKJ, KKA et JBL ont développé la méthodologie. JKJ et JBL ont entrepris la visualisation des données. JKJ et CMA ont développé le logiciel. JKJ, KKA, CMA et JBL ont écrit l'article. JKJ et JBL ont organisé les données. JBL a acquis un financement pour l'étude. JKJ et CMA ont validé les résultats. JKJ et JBL ont géré et coordonné l'étude. JKJ et JBL ont supervisé la recherche.

Correspondance à Julius B. Lucks.

KKA, JKJ et JBL ont déposé une demande de brevet internationale nationalisée aux USA (N° US 17/309 240) et en Europe (N° EP19881824.7) relative aux réactions de transcription in vitro régulées, une demande de brevet international (PCT/US2020/030112, N° 62/838 852) relative à la conservation et à la stabilisation des réactions de transcription in vitro et une demande provisoire américaine (PCT/US 2020/030112 ou US provisoire n° 63/154 247) concernant des biocapteurs acellulaires avec des circuits de déplacement de brin d'ADN. KKA et JBL sont les fondateurs et ont des intérêts financiers dans Stemloop, Inc. Ces derniers intérêts sont examinés et gérés par la Northwestern University conformément à leurs politiques en matière de conflits d'intérêts. CMA ne déclare aucun intérêt concurrent.

Nature Chemical Biology remercie Jérôme Bonnet et le(s) autre(s) relecteur(s) anonyme(s) pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, En présence de composants IVT, l'ARNP T7 peut se lier de manière non spécifique à la région du pied de la porte du signal d'ADN. Lorsque le pied est à l'extrémité 3 'de la porte, cela conduit à la transcription de produits secondaires d'ARN indésirables qui peuvent déplacer le brin d'extincteur. Ce processus est bloqué lorsque le pied est à l'extrémité 5' de la porte. b, la porte de signal d'ADN de pied 3 'conduit à l'activation de la fluorescence en présence de T7 RNAP, tandis que la porte de signal d'ADN de pied 5' ne le fait pas. c, lorsque les produits de réaction de b ont été extraits et exécutés sur un gel d'urée-polyacrylamide, les produits secondaires d'ARN n'apparaissent qu'à partir de la porte de signal d'ADN 3 'toehold. Un contrôle négatif où aucune porte de signal d'ADN n'est présente dans la réaction (–) a été exécuté parallèlement pour les orteils 3 'et 5'. d, la modification de la porte de l'ADN avec des oligonucléotides 2'-O-méthyle empêche la transcription indépendante du promoteur par T7 RNAP. e, lorsque la porte de signal d'ADN 3 'toehold est modifiée avec des oligonucléotides 2'-O-méthyl, aucune activation de fluorescence n'est observée en l'absence d'une matrice IVT pilotée par RNAP T7. f, lorsque les réactions de e ont été exécutées sur un gel d'urée-polyacrylamide, aucun produit secondaire d'ARN n'a été observé à partir de la porte de signal d'ADN 2'-O-méthyle. Un contrôle négatif où aucune porte de signal d'ADN n'est présente dans la réaction (-) a été exécuté parallèlement pour les portes non modifiées et modifiées. Les données présentées en b et e sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec une fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine μM). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± l'écart type. Les données présentées en c et f sont représentatives de n = 3 répétitions biologiques indépendantes. L'image de gel non recadrée et non traitée illustrée en c et f est disponible en tant que données source.

Données source

a, Les huit nucléotides initialement transcrits de chaque variant d'InvadeR sur la figure 2a. Les nucléotides qui ne font pas partie des séquences InvadeR sont en gras et les nucléotides insérés sont soulignés. b, Concentrations de chaque variant des réactions IVT mesurées par le kit de test Qubit RNA HS (Invitrogen, catalogue n° Q32852). Chaque variant a été produit in situ en présence de la porte de signal d'ADN pendant 30 min et extrait (voir la section Extraction d'ARN à partir de réactions IVT dans Matériels et méthodes). La concentration de la variante 1 était trop faible pour la quantification Qubit. c, Les échantillons mesurés en b ont été passés sur un gel d'urée-polyacrylamide et colorés avec de l'or SYBR. Le titrage d'un étalon d'ARN de longueur similaire a été effectué pour déterminer la plage linéaire de la zone de pic de bande quantifiée par Fiji – ImageJ56. d, Une courbe d'étalonnage a été construite en traçant la surface du pic calculée à partir de la quantification Fiji – ImageJ par rapport à la quantité totale d'étalon chargé. e, En utilisant la courbe d'étalonnage en d, la quantité totale d'ARN pour chaque variant a été déterminée et comparée aux mesures effectuées par Qubit en b. Les données en b sont présentées pour n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous la forme d'un point avec la hauteur de la barre représentant la moyenne. Les barres d'erreur indiquent la moyenne des répliques ± écart type. Les données présentées en c sont représentatives de n = 3 répétitions biologiques indépendantes. L'image de gel non recadrée et non traitée illustrée en c est disponible en tant que données source.

Données source

Les matrices d'ADN codant pour InvadeR sont modifiées pour contenir le promoteur T7 suivi d'un espaceur de 2 pb et d'une séquence opérateur aTF en amont de la séquence InvadeR. Les structures secondaires, les énergies libres minimales et les probabilités d'appariement de bases de a, GG–tetO–InvadeR, b, GG–ttgO–InvadeR et c, GA–smtO–Hairpin2–InvadeR (variante d'espacement 1BP) sont prédites à l'aide de NUPACK à 37 °C30. La séquence GA – smtO – Hairpin2 – InvadeR comprend une épingle à cheveux conçue pour minimiser les interférences structurelles d'InvadeR par smtO (Extended Data Fig. 4h, i). La séquence complémentaire de la porte du signal est indiquée par une ligne pointillée et mise en surbrillance en vert. d, TetR est utilisé pour détecter la tétracycline. e, TtgR, un aTF de la famille MarR, est utilisé pour détecter la naringénine. f, SmtB est utilisé pour détecter le zinc. Les variations de la cinétique d'activation correspondent à la tendance selon laquelle la structure secondaire prédite d'InvadeR a un impact sur la vitesse d'induction. Pour évaluer la limite de détection de chaque capteur, une courbe dose-réponse a été créée pour g, tétracycline, h, naringénine et i, ZnSO4 (données finales à 1 h). Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous forme de ligne (d – f) ou de point (g – i) avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). L'ombrage (d–f) et les barres d'erreur (g–i) indiquent la moyenne des répétitions ± l'écart type. Les concentrations de ligand auxquelles les signaux se distinguent de l'arrière-plan ont été déterminées à l'aide d'un test t de Student hétéroscédastique bilatéral contre la condition sans ligand, et leurs plages de valeurs P sont indiquées par des astérisques (*** P <0, 001, ** P = 0, 001–0, 01, * P = 0, 01–0, 05). Les valeurs P exactes ainsi que les degrés de liberté peuvent être trouvés dans les données sources. Les données pour la condition sans ligand ont été exclues car l'axe des x est sur l'échelle logarithmique et sont présentées dans Source Data.

Données source

a, Structure secondaire, énergie libre minimale et probabilités d'appariement de bases de GA-smtO–InvadeR prédites par NUPACK à 37 °C30. Une partie de la séquence smtO de type sauvage forme une tige-boucle prédite forte avec InvadeR. Les nucléotides surlignés en vert correspondent à la séquence InvadeR qui déplace le brin de la porte du signal d'ADN. b, Structure secondaire, énergie libre minimale et probabilités d'appariement de bases de GA-smtO–InvadeR–InvadeR prédites par NUPACK à 37 °C30. c, Comparaison de la cinétique de la réaction non régulée GA-smtO–InvadeR et de la réaction non régulée GA-smtO–InvadeR–InvadeR. d, e, structures secondaires prédites par NUPACK, énergies libres minimales et probabilités d'appariement de bases des deux variantes GA-smtO – Hairpin – InvadeR conçues pour séquestrer la séquence smtO et l'empêcher de se lier à InvadeR. Les nucléotides surlignés en gris indiquent la séquence séquestrante ajoutée. f, Comparaison des cinétiques des réactions non régulées des variants représentés en d et e. g, Les variantes GA-smtO – Hairpin2 – InvadeR ont été construites en allongeant soit la longueur de la tige, soit l'espaceur entre l'épingle à cheveux et la séquence InvadeR. Les variantes de longueur de tige sont construites avec l'espaceur 0-nt, et les variantes d'espacement sont construites avec la longueur de tige 12-bp. h, i, Comparaison de la cinétique des réactions non régulées des variants GA-smtO–Hairpin2–InvadeR. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). Les ombrages indiquent la moyenne des répliques ± l'écart type.

Données source

Les simulations de portes logiques décrites dans les Fig. 4, 5 et données étendues Fig. 7 sont présentés avec les tendances de trajectoire simulées attendues. Tous les codes de bloc-notes Jupyter utilisés pour simuler les résultats sont disponibles en tant que données supplémentaires 6, et la méthode utilisée pour développer le modèle ODE pour chaque porte logique représentative est décrite dans les informations supplémentaires.

Données source

a, La séquence et la conception de la porte AND de l'ADN illustrées à la Fig. 4c. Les mésappariements agissent comme le moteur thermodynamique pour faire avancer la réaction. Le domaine de serrage empêche le toron supérieur d'être déplacé uniquement avec l'entrée 1 (orange). b, Sans conducteurs thermodynamiques, aucun signal n'est observé. L'allongement de la pince réduit la fuite par l'entrée 1. La fuite observée à partir de la pince ac, 3-bp, d, 5-bp et e, 7-bp. f, Les séquences et les conceptions des portes InvadeR et RNA NOT sans séquences d'opérateurs. La non-concordance entre InvadeR et la porte du signal est surlignée en rouge. La variante 2 incorpore 6 adénines supplémentaires qui renforcent ses interactions avec la porte NOT. La porte NOT 1 a une emprise de 4 nt tandis que les portes NOT 2 et 3 ont des emprises de 6 nt. La porte 3 de NOT a une adénine supplémentaire après les guanines d'initiation qui augmente son efficacité de transcription36. Titrage du modèle codant NOT gate 1 en présence de 25 nM du modèle codant InvadeR g, variante 1 et h, variante 2. Alors que la variante 2 nécessite plus de modèle de porte NOT pour bloquer le signal, un signal plus fort est observé à partir de la variante 2 sans la porte NOT. Titrage de la matrice codant la porte NOT i, 2 et j, 3 en présence de 25 nM de la matrice InvadeR variant 2. Les portes NOT 2 et 3 sont plus efficaces pour séquestrer InvadeR que la porte NOT 1. k, L'incorporation de la séquence d'opérateurs dans la porte NOT a un impact sur sa structure. NUPACK prédit que la séquence smtO (gris clair) interagit avec une partie de la porte NOT 3, bloquant le pied30. Une séquence d'espacement (soulignée) peut restaurer la structure attendue de la porte NOT. Titrage de la matrice codant l, smtO–NOT gate 3 et k, smtO–spacer–NOT gate 3 en présence de 25 nM de la matrice InvadeR variant 2. Toutes les réactions présentées sont non réglementées. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec une fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine µM). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± l'écart type.

Données source

a, Porte NOT induite par la tétracycline illustrée à la Fig. 4e. b, un modèle codant pour la séquence mélangée de la porte NOT régulée par TetR a été utilisé comme contrôle pour démontrer que la réduction du signal induite par la tétracycline n'est pas due à des limitations de ressources. c, la porte NOT induite par le ZnSO4 peut être conçue de la même manière. La séquence d'espacement a été ajoutée pour empêcher la séquence smtO de perturber la structure de la porte NOT (Extended Data Fig. 6). d, En présence de ZnSO4, le signal de fluorescence est désactivé. De même, des réactions de contrôle avec un modèle codant pour la séquence mélangée de la porte NON régulée par SmtB sont présentées. e, une porte tet IMPLY ZnSO4 conçue comme décrit sur la figure 5c. f, l'activation de la fluorescence est observée à moins que seule la tétracycline soit ajoutée. g, Une porte tet IMPLY ZnSO4 peut également être construite en incluant un modèle inductible par ZnSO4 qui interagit avec la porte du signal au lieu de la porte OU. h, La porte alternative IMPLY effectue le calcul logique attendu. Une génération de signal plus rapide à partir des conditions induites par le ZnSO4 est observée puisque les brins d'ARN induits par le ZnSO4 effectuent directement le TMSD sur la porte du signal. i, L'approche alternative pour construire la porte IMPLY peut être appliquée à la porte tet ZnSO4 IMPLY, et j, la porte effectue le calcul logique attendu. k, Une porte tet NIMPLY ZnSO4 est conçue de la même manière que la porte tet ZnSO4 NIMPLY illustrée à la Fig. 5g. l, La porte tet NIMPLY ZnSO4 effectue le calcul logique attendu. Toutes les conditions expérimentales utilisées dans cette figure se trouvent dans les données supplémentaires 5. Toutes les données présentées sont n = 3 réplicats biologiques indépendants, chacun tracé comme une ligne avec une fluorescence brute normalisée au MEF (fluorescéine µM). L'ombrage indique la moyenne des répliques ± l'écart type.

Données source

Les traces cinétiques correspondant aux données présentées sur la figure 6e sont présentées pour la porte de seuil de 8 nt dans différents rapports au-dessus d'une concentration de porte de signal fixe (a, 0X, b, 1X, c, 2X et d, seuil 3X). Le moment (t = 100 min) auquel la carte thermique a été créée est indiqué par une ligne pointillée verticale. Les différences de vitesse de réponse pour différentes concentrations de zinc sont essentielles pour créer la norme. e, Les conditions de zinc à 10 μM et 30 μM ne montrent aucune différence cinétique sans grille de seuil. f, g, La caractérisation fonctionnelle et les prédictions ODE du circuit ADC à 100 min de la Fig. 6e, d, respectivement, y compris les conditions de seuil de zinc 30 μM et 4X. Les conditions de zinc 10 μM et 30 μM se comportent de manière identique comme prévu par le modèle ODE en raison de leur comportement cinétique identique observé dans e. h, les données correspondantes du graphique à barres de l'étalon semi-quantitatif indiqué en f. Toutes les données présentées sont n = 3 réplicats biologiques indépendants, chacun tracé sous la forme d'une ligne (a – e) ou d'un point (h) avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). Les barres en h et les valeurs sur la carte thermique en f représentent les moyennes des répétitions. Les ombres dans a–e et les barres d'erreur dans h indiquent la moyenne des répétitions ± l'écart type.

Données source

Les réactions non régulées ont été lyophilisées pendant une nuit avec l'ajout de 50 mM de saccharose et de 250 mM de D-mannitol comme lyoprotecteurs, sauf indication contraire. Les réactions lyophilisées ont ensuite été emballées sous vide dans un sac de protection léger avec une carte dri et conservées dans une zone fraîche et ombragée jusqu'à utilisation (voir Matériels et méthodes pour le protocole détaillé). Des traces cinétiques de réactions réhydratées après a, 1 jour, b, 4 jours et c, 7 jours de stockage sont présentées. Il y a une diminution du signal global ainsi que de la vitesse de réponse au fil du temps. Pour étudier la cause de la perte de signal au fil du temps, la porte de signal d'ADN seule a été lyophilisée pendant la nuit avec ou sans les lyoprotecteurs, emballée et stockée comme décrit ci-dessus. La porte de signal d'ADN a été réhydratée avec le reste des composants IVT après j, 1 jour, e, 4 jours et f, 7 jours. La vitesse de réponse ainsi que l'amplitude du signal sont maintenues, ce qui indique que la perte de signal est probablement due à l'instabilité de certains composants IVT. Pour tester cette hypothèse, des réactions non régulées avec des NTP tamponnées au Tris, au lieu de NTP tamponnées au NaOH, ont été lyophilisées avec les lyoprotecteurs, conditionnées et stockées comme décrit ci-dessus. Des traces cinétiques de réactions réhydratées après g, 1 jour, h, 4 jours et i, 7 jours de stockage sont présentées. La perte de signal est quelque peu atténuée avec les NTP tamponnés au Tris, mais un degré similaire de perte de signal est observé pour un stockage à long terme des réactions lyophilisées. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes chacune tracée comme une ligne avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). Les ombrages indiquent la moyenne des répliques ± l'écart type.

Données source

ROSALIND à détection de zinc avec des réactions TMSD qui utilisent smtO – InvadeR – InvadeR illustrées dans les données étendues Fig. 4b ont été lyophilisées et réhydratées avec a, de l'eau du robinet et b, de l'eau du lac Michigan dopée avec une gamme de concentrations de ZnSO4. Les réactions ont ensuite été incubées à 37°C pendant 1 heure et caractérisées pour la fluorescence. Pour chaque type d'échantillon d'eau, le signal a été comparé à celui des réactions réhydratées avec de l'eau de qualité laboratoire additionnée de la même quantité de ZnSO4. Dans chaque cas, les réactions se sont comportées comme prévu et n'ont vu aucune différence de signal entre les échantillons d'eau filtrés et non filtrés. Cependant, une légère réduction du signal est observée à partir des échantillons d'eau du monde réel par rapport à ceux réhydratés avec l'eau de qualité laboratoire enrichie en ZnSO4, probablement en raison d'effets de matrice. Toutes les données présentées sont n = 3 répétitions biologiques indépendantes, chacune tracée sous forme de point avec des valeurs de fluorescence brutes normalisées au MEF (fluorescéine μM). Chaque hauteur de barre représente la moyenne des répliques et les barres d'erreur indiquent la moyenne des répliques ± écart type.

Données source

Fig. supplémentaires. 1–5 et Méthode sur la modélisation ODE utilisée dans cette étude.

Séquences d'ADN et de protéines utilisées dans cette étude.

Image de gel d'urée-PAGE brute illustrée à la Fig. 2d supplémentaire.

Données calibrées du lecteur de plaque pour les chiffres supplémentaires.

Conceptions et séquences de toutes les portes logiques construites dans cette étude et leurs sources.

Conditions expérimentales (ligands, aTFs, matrices d'ADN et concentrations de portes d'ADN) utilisées pour toutes les portes logiques et leurs paramètres cinétiques utilisés pour les simulations ODE.

Codes de bloc-notes Jupyter utilisés pour simuler les résultats présentés dans Extended Data 5, Extended Data 8 et Fig. 6.

Données source du lecteur de plaque calibré pour la Fig. 2.

Données source du lecteur de plaque calibré pour la Fig. 3.

Données source du lecteur de plaque calibré pour la Fig. 4.

Données source du lecteur de plaque calibré pour la Fig. 5.

Données source du lecteur de plaque calibré pour la Fig. 6.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 1.

Gels d'urée-PAGE non transformés et non cultivés illustrés dans les données étendues Fig. 1 et leurs brèves descriptions.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 2.

Gel d'urée-PAGE non traité et non recadré illustré dans les données étendues Fig. 2 et sa brève description.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 3.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 4.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 5.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 6.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 7.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 8.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 9.

Données source du lecteur de plaque calibré pour les données étendues Fig. 10.

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Réimpressions et autorisations

Jung, JK, Archuleta, CM, Alam, KK et al. Programmation de biocapteurs acellulaires avec des circuits de déplacement de brins d'ADN. Nat Chem Biol 18, 385–393 (2022). https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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Reçu : 29 janvier 2021

Accepté : 16 décembre 2021

Publié: 17 février 2022

Date d'émission : avril 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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